Experiment amb làser d'estat sòlid-ultraviolat profund de 222 nm-3
5.2.4 Sortida de làser-pulsat ultraviolat de 222 nm de profunditat
Figura 5.16 Variació de la potència mitjana i de l'amplada del pols del làser polsat de 457 nm amb la potència de la bomba injectada a una freqüència de repetició de 15 kHz
L'eix esquerre representa la potència mitjana del làser de 457 nm en mW (200-700), l'eix dret representa l'amplada del pols en ns (40-120) i l'eix horitzontal representa la potència de la bomba injectada en W (30-42).
Una corba correspon a la potència mitjana a f=15kHz, que disminueix d'aproximadament 650 mW a uns 350 mW. L'altra corba correspon a l'amplada del pols, augmentant d'aproximadament 50 ns a uns 110 ns.
Figura 5.17 Qualitat del punt i del feix del làser polsat de 457 nm a una potència mitjana màxima de 600 mW amb una freqüència de repetició de 10 kHz (vegeu el diagrama de colors)
La part esquerra és un diagrama de punts i la part dreta és un diagrama de qualitat del feix.
Al diagrama de qualitat del feix, l'eix horitzontal és la posició al llarg de l'eix de propagació en mm (0-200) i l'eix vertical és el diàmetre del punt en mm (0-4). Hi ha dues corbes anomenades "x horitzontal" i "y vertical", amb My²=1.32 i Mx²{=1.15.. Les corbes primer disminueixen i després augmenten, amb el valor mínim d'uns 100 mm i un diàmetre de punt d'aproximadament 0,5 mm.
A partir de l'esmentat experiment làser polsat de 457 nm, la sortida del làser polsat de 457 nm amb la potència màxima més alta s'obté quan el radi del punt de la bomba és d'aproximadament 200 μm, L1 i L2 són d'aproximadament 83 mm i 31 mm i la freqüència de repetició és de 10 kHz. Aquest làser polsat de 457 nm s'utilitza com a font de llum per generar làser polsat de 222 nm mitjançant la duplicació de freqüència amb un cristall BBO. Perquè les posicions de col·locació del mirall d'enfocament M3 i el cristall BBO aconsegueixin una sortida contínua de 222 nm, ja que la qualitat del feix de la sortida del làser polsat de 457 nm difereix de la de 457 nm, cal ajustar adequadament les posicions de col·locació del mirall d'enfocament M3 i el cristall BBO. Això garanteix que després que el làser polsat de 457 nm passi pel mirall d'enfocament M3, la seva longitud de Rayleigh coincideixi amb la longitud del cristall BBO per millorar l'eficiència de duplicació de freqüència. Finalment, s'aconsegueix una sortida làser polsada de 222 nm amb una potència mitjana màxima de 35 mW i una amplada de pols de 36 ns (mesurada per la incidència directa del làser al detector). Tot i que hi ha opcions comercials com ara led uvc de 222 nm o la làmpada uvc de 222 nm per a aplicacions més àmplies, aquest sistema-sòlid proporciona una sortida polsada precisa. La figura 5.18 mostra l'espectre del làser ultraviolat. La potència mitjana de sortida del làser polsat de 222 nm augmenta amb l'augment de la potència injectada del làser polsat de 457 nm, i la relació de variació es mostra a la figura 5.19. La figura 5.20 és el diagrama de punt làser del làser polsat de 222 nm a la potència de sortida mitjana més alta.
Figura 5.18 Espectre làser ultraviolat
L'eix horitzontal és la longitud d'ona en nm (200-260) i l'eix vertical és la intensitat (0-15000). El pic és d'uns 222 nm.
Figura 5.19 Variació de la potència mitjana de sortida del làser polsat de 222 nm amb la potència injectada del làser polsat de 457 nm amb una freqüència de repetició de 10 kHz
L'eix horitzontal és la potència injectada del làser de 457 nm en mW (200-600) i l'eix vertical és la potència mitjana del làser de 222 nm en mW (0-40). La corba augmenta linealment, d'aproximadament 5 mW a uns 35 mW.
Figura 5.20 Punt làser de làser polsat de 222 nm a la potència de sortida mitjana més alta (vegeu el diagrama de colors)
La taca té forma d'anell amb un contorn quadrat.
Figura 5.21 Estabilitat de la potència de sortida del làser polsat de 222 nm
Quan la potència de sortida mitjana màxima del làser polsat de 222 nm és de 35 mW, es mesura l'estabilitat de la potència de sortida del làser. Tal com es mostra a la figura 5.21, l'estabilitat de la sortida del làser en 2 hores és del 2%.
L'eix horitzontal és el temps en minuts (0-120) i l'eix vertical és la potència mitjana del làser de 222 nm en mW (0-50). La corba és bàsicament estable, fluctuant al voltant dels 35 mW.
5.3 Experiment sobre la inactivació bacteriana mitjançant làser polsat de 222 nm
5.3.1 Principi i avantatges de l'aplicació de la llum ultraviolada llunyana-per a la inactivació bacteriana
El 1903, Niels Finsen va rebre el Premi Nobel per descobrir que la llum ultraviolada pot matar els bacteris. Durant el segle següent, la llum ultraviolada s'ha utilitzat àmpliament com a mètode de desinfecció en la desinfecció d'articles, sales i altres llocs públics. Durant la pandèmia COVID-19 en curs, els països de tot el món necessiten urgentment nous mètodes per inactivar els virus a l'aire. Hi ha dos mètodes principals d'esterilització i desinfecció fotodinàmica: l'acció fotoquímica i l'acció fototèrmica.
(1) Acció fotoquímica Els àcids nucleics de la informació genètica (ADN/ARN) dels bacteris absorbeixen una gran quantitat de llum ultraviolada quan s'irradien. Això condueix a la formació d'isòmers de diazabenzens i diazabenzens al cos, tal com es mostra a la figura 5.22. Aquesta substància altera les funcions metabòliques dels bacteris, impedint que es reprodueixin fins que moren. Aquesta acció fotoquímica és el principal mecanisme de desinfecció de la llum ultraviolada tradicional. Tanmateix, per als microorganismes de motlle i espores, la llum ultraviolada té dificultats per penetrar en les seves denses estructures de paret cel·lular, de manera que l'ADN no pot absorbir la llum ultraviolada, la qual cosa resulta en una eficiència de desinfecció relativament baixa per a aquests microorganismes.
Figura 5.22 Diagrama esquemàtic de la dimerització de la timina de l'ADN de doble -cadena sota irradiació amb llum ultraviolada (vegeu el diagrama de colors)
Mostra el procés de l'ADN de doble cadena-formant dímers de timina sota radiació UV.
(2) Acció fototèrmica La irradiació de llum polsada pot augmentar ràpidament la temperatura superficial de les cèl·lules, destruint les parets cel·lulars dels bacteris, evaporant el líquid cel·lular i danyant completament les estructures cel·lulars, provocant la mort. L'acció fototèrmica és l'augment de temperatura provocat per l'absorció d'energia lumínica per part de les substàncies. Quan els microorganismes són irradiats per llum polsada intensa a poca distància, absorbeixen una gran quantitat d'energia lluminosa en poc temps, fent que la seva temperatura superficial augmenti bruscament i les seves estructures superficials quedin completament destruïdes, provocant la mort. Com que tot el procés d'acció fototèrmica és molt curt, no hi ha augment de temperatura dins de l'objecte irradiat, de manera que bàsicament no afecta els nutrients. Segons el mecanisme de desinfecció fototèrmica, la llum polsada intensa pot matar efectivament tots els microorganismes. La llum ultraviolada polsada combina accions fotoquímiques i fototèrmiques per a l'esterilització i la desinfecció, de manera que la seva eficiència teòrica de desinfecció és superior a la d'un sol mètode. La font de llum ultraviolada tradicional per a l'esterilització és una làmpada de vapor de mercuri. Tanmateix, la longitud d'ona màxima de la llum ultraviolada emesa per les làmpades de vapor de mercuri és de 254 nm, que és perjudicial per a les cèl·lules i els teixits humans, i pot causar càncer de pell [4] i cataractes en casos greus. La investigació de l'última dècada ha demostrat que la llum ultraviolada a la banda de 200-230 nm pot inactivar bacteris, virus de la grip a l'aire i patògens com el SARS-CoV{-2 sense danyar les cèl·lules humanes. A nivell internacional, la llum-ultraviolada profunda a la banda de 200-230 nm s'anomena "llum-ultraviolada llunyana", sovint implementada mitjançant sistemes de llum ultraviolada llunyana de 222 nm. L'any 2022, els Jocs Olímpics d'hivern de Pequín van utilitzar àmpliament la llum-ultraviolada llunyana per a l'esterilització i la desinfecció, i es va referir a això com una "vacuna lleugera". Per a aquells que busquen llum uv de 222 nm a la venda, les opcions inclouen mòduls led uvc de 222 nm o accessoris de làmpada uvc de 222 nm, que ofereixen avantatges similars de llum ultraviolada llunyana de 222 nm en formes compactes. En comparació amb la llum ultraviolada típica de 254 nm per a l'esterilització, el principi biofísic que la llum ultraviolada llunyana és inofensiva per a les cèl·lules humanes és que les proteïnes tenen un pic d'absorció en aquesta banda. En aquest experiment, s'utilitza un espectrofotòmetre per mesurar l'espectre d'absorció de proteïnes, tal com es mostra a la figura 5.23. A la figura 5.23 es pot veure que les proteïnes tenen una absorció de llum molt baixa a la banda típica de 254 nm, però una absorció relativament alta a la banda de 200-230nm. La llum ultraviolada llunyana pot travessar microorganismes molt més petits que les cèl·lules humanes (els diàmetres típics de bacteris i virus són 1 μm i 0,1 μm) [11], mentre que el diàmetre de les cèl·lules humanes típiques oscil·la entre 10 i 25 μm. La llum ultraviolada llunyana és fortament absorbida per proteïnes del citoplasma humà i s'atenua bruscament abans d'arribar al nucli de la cèl·lula humana [6]. Per exemple, la capa més externa de la pell humana és l'estrat corni, format per queratinòcits anucleats morts. La funció principal de l'estrat corni és protegir el teixit subcutani subjacent. La major part de la llum ultraviolada llunyana irradiada és absorbida per proteïnes al citoplasma de l'estrat còrni de la pell i no pot penetrar a l'estrat còrni de la pell per arribar a les cèl·lules basals clau o melanòcits a continuació, tal com es mostra a la figura 5.24. Per als ulls humans, el teixit sensible a la llum ultraviolada és la lent. Tanmateix, la lent es troba a la part posterior de la còrnia i la còrnia té uns 500 μm de gruix. Per tant, la transmitància de la llum ultraviolada llunyana a través de la còrnia fins a la lent és bàsicament zero.
Figura 5.23 Espectre d'absorció de proteïnes
L'eix horitzontal és la longitud d'ona en nm (200-300) i l'eix vertical és el valor d'absorció (0-3,0). Hi ha tres punts a la corba: (222, 1,41), (230, 1,25) i (254, 0,168). El valor d'absorció disminueix a mesura que augmenta la longitud d'ona.
Figura 5.24 Diagrama esquemàtic de la propagació de la llum ultraviolada llunyana-a la pell i els patògens
El costat esquerre mostra l'estructura de la pell, on l'estrat corni absorbeix la llum ultraviolada llunyana{0}}. El costat dret mostra el patogen augmentat, on penetra-la llum ultraviolada llunyana i actua sobre bacteris i virus.
5.3.2 Experiment sobre la inactivació bacteriana mitjançant làser polsat de 222 nm
Preparació bacteriana Escherichia coli és àmpliament present a la natura i és un patogen clau en la salut pública humana, una de les espècies més -resistents als medicaments de les enterobacteries, i s'utilitza sovint en investigacions sobre desinfecció ultraviolada i higiene ambiental. El bacil està estretament relacionat amb els humans en la intoxicació alimentària, i a causa de la resistència a la calor i a l'àcid de les seves espores, no es pot eliminar mitjançant la pasteurització o els procediments d'higiene normals. Per tant, les soques bacterianes utilitzades en aquest experiment són Escherichia Coli i Bacillus Cereus. Escherichia coli i Bacillus són Escherichia coli [Escherichia coli CMCC (B) 44102] proporcionades pel Laboratori Clau d'Ecologia de l'Illa Tropical del Ministeri d'Educació, la Universitat Normal de Hainan, i la subespècie Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1 del Laboratori de Microbiologia Ambiental de la Universitat Normal d'Investigació d'Ecologia de Hainan, respectivament. Escherichia coli i Bacillus es cultiven en medi d'agar nutritiu, col·locat en una incubadora a 35 graus i 5% CO₂, amb un període de cultiu de 24h. El medi d'agar nutrient el proporciona Guangdong Huankai Microbial Technology Co., Ltd., i els seus components inclouen peptona, pols d'extracte de vedella, clorur de sodi i agar, amb un pH final ≈ 7,3. Els bacteris cultivats s'observen mitjançant la preparació de portaobjectes. Prenent Escherichia coli com a exemple, els passos de preparació de la diapositiva es mostren a la figura 5.25, i els resultats de l'observació es mostren a la figura 5.26.
Recollida de diapositives: les diapositives s'emmagatzemen en una solució alcohòlica, es treuen i s'assequen amb un bufador d'aire calent.
Gota d'aigua estèril: sota un banc de treball molt-net, deixeu caure una gota d'aigua estèril sobre el portaobjectes (no massa gran) per diluir els bacteris.
Mostra: utilitzeu l'extrem pla d'un escuradents esterilitzat per submergir suaument els bacteris de la colònia; l'escuradents no es pot reutilitzar.
Remenar: remenar els bacteris en el sentit de les agulles del rellotge perquè es distribueixin completament i uniformement a la gota d'aigua.
Cocció: assecar el portaobjectes tractat per fixar els bacteris al portaobjectes.
Tinció: deixeu caure el reactiu Coomassie Brilliant Blue (tòxic, operar amb guants) a la diapositiva, fent que la gota només cobreixi la placa bacteriana i deixeu-la reposar durant més de 15 segons.
Esbandida: esbandida l'excés de reactiu Coomassie Brilliant Blue amb un flux d'aigua lent, tenint cura de no esbandir directament la placa bacteriana per evitar rentar-la.
Observació: Col·loqueu el portaobjectes a l'etapa del microscopi, deixeu caure una gota d'oli sobre la placa bacteriana i, a continuació, observeu amb una lent d'immersió en oli.
Figura 5.25 Passos de preparació del portaobjectes bacterians
Inclou un procés d'imatge de vuit passos: "presa i assecat de la diapositiva", "gota d'aigua estèril", "presa de mostres", "remenar", "enfornar", "tacar", "esbandir" i "observar".
Figura 5.26 Imatge del bacil observat al microscopi
Mostra un gran nombre de bacils-en forma de vareta.
Efecte de la inactivació bacteriana La font d'irradiació és un làser ultraviolat llunyà-sòlid-sòlid-polsat de 222 nm desenvolupat en aquest treball, amb una amplada de línia espectral inferior a 0,1 nm. Tota l'operació experimental es porta a terme en una sala neta. Les eines experimentals s'esteril·litzen amb un esterilitzador d'alta-pressió i el banc de treball s'irradia amb llum ultraviolada durant 1 h abans de l'experiment per evitar la contaminació bacteriana del medi ambient. La cubeta es segella després de col·locar la suspensió bacteriana per evitar el contacte directe de la suspensió amb l'aire exterior. Al llarg de l'experiment, els bacteris es troben en un líquid nutritiu per evitar errors experimentals causats per la mort natural. Agafeu mostres d'1 ml de suspensions d'Escherichia coli i Bacillus amb una certa concentració i col·loqueu-les en una cubeta amb alta transmissió a la-banda ultraviolada d'ona curta. Enceneu el làser i, ajustant la potència de sortida del làser i la posició de col·locació de la cubeta, la irradiància del làser de 222 nm a la cubeta és de 0,1 mW/cm². Utilitzeu làser de 0,1 mW/cm² de 222 nm per irradiar mostres de suspensió d'Escherichia coli i Bacillus per a diferents temps d'irradiació. La figura 5.27 (a) mostra un làser de 222 nm que passa verticalment per la suspensió d'Escherichia coli. Les mostres de control i les mostres irradiades es cultiven durant 24 hores més, i la distribució dels bacteris no irradiats i irradiats es mostra a les figures 5.27 (b) i (c). El mètode de recompte de plaques d'agar nutrient s'utilitza per determinar el recompte de bacteris d'Escherichia coli al grup control i després de la irradiació. Per millorar la precisió de les dades experimentals, cada mostra es repeteix 3 vegades sota la mateixa dosi d'irradiació i es pren el valor mitjà.
Figura 5.27 222nm Experiment d'esterilització per làser polsat
(a) Suspensió d'Escherichia coli sota irradiació;
(b) Distribució d'Escherichia coli després de 0, 10 i 20 segons d'irradiació, amb el nombre de colònies a la placa que disminueix amb l'augment del temps d'irradiació;
( c ) Distribució de Bacillus després de 0, 30 i 60 s d'irradiació, amb el nombre de colònies a la placa que disminueix amb l'augment del temps d'irradiació.
Els resultats de la prova es mostren a la taula 5.1. Quan el làser de 222 nm irradia la suspensió d'Escherichia coli durant 10 segons (1 mJ/cm²), la taxa d'inactivació és del 90,7%; durant 15 s (1,5 mJ/cm²), la taxa d'inactivació és del 96,9%; i durant 20 segons (2 mJ/cm²), la taxa d'inactivació és tan alta com el 100%. Quan el làser de 222 nm irradia la suspensió de Bacillus durant 30 segons (3 mJ/cm²), la taxa d'inactivació és del 88,4%; durant 45 s (4,5 mJ/cm²), la taxa d'inactivació és tan alta com el 98,6%; i durant 60 segons (6 mJ/cm²), la taxa d'inactivació és tan alta com el 100%. Aquest estudi experimental mostra que la irradiació amb làser polsat-ultraviolat llunyà de 222 nm a dosis de 2 mJ/cm² i 6 mJ/cm² pot inactivar efectivament Escherichia coli i Bacillus, respectivament. D'aquest experiment i d'altres informes de la literatura es pot veure que la dosi d'irradiació necessària per inactivar Bacillus per llum ultraviolada és més gran que la d'Escherichia coli. La raó és que la dosi d'irradiació necessària per inactivar bacteris i virus per la llum ultraviolada està relacionada principalment amb factors com la mida dels microorganismes, el gruix de les membranes cel·lulars (parets) i l'estructura dels àcids nucleics (cadena simple o bicatenària). En general, com més gran sigui la mida del microorganisme i més gruixuda sigui la membrana cel·lular, més dosi d'irradiació es requerirà; els microorganismes amb estructures de doble-cadena tenen capacitats de reparació més fortes que els que tenen estructures de-cadena simple, de manera que també es requereix més dosi d'irradiació. Tant Bacillus com Escherichia coli tenen estructures de doble cadena -, però la mida i el gruix de la paret cel·lular de Bacillus són (1,0 ~ 1,2) nm × (3,0 ~ 5,0) nm i 20 ~ 80 nm, respectivament, mentre que els d'Escherichia coli són només (0,5 ~ 0,1) nm × (0,1) nm i (0,8) nm. 11 nm. Per tant, la dosi d'irradiació ultraviolada necessària per inactivar Bacillus és més gran que la d'Escherichia coli.
